商品カテゴリから選ぶ
メーカーから選ぶ
商品名を入力

2018年10月
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12 13
14 15 16 17 18 19 20
21 22 23 24 25 26 27
28 29 30 31
2018年11月
1 2 3
4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15 16 17
18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30

※赤字は休業日です

商品コード:
BCSQ

バイサルファイトシーケンス解析

関連カテゴリ:
受託解析サービス > DNAメチル化解析
バイサルファイトクローナルシーケンス

バイサルファイトシーケンス解析(クローニング法)

●ご用意いただくのは遺伝子情報とサンプルのみ
●PCR, バイサルファイト処理, クローニングは不要
●サンプルごとに解析領域の各CpGサイトのメチル化結果を報告

必要サンプル量
ゲノムDNA: >1ug
細胞: >1 x 105
組織: >10mg
FFPE: >10um x 5

解析データ
DNA QCデータ
CpGサイト情報
プライマー配列情報
シーケンス波形データ


 

実験・解析ワークフロー

ゲノムDNA ⇒ バイサルファイト処理 ⇒ PCR ⇒ 形質転換 ⇒ プラスミド抽出 ⇒ シーケンス

1. DNA QC
分光光度計とアガロースゲル電気泳動により、DNAの品質検査を行います
OD260/OD230 > 2.0 , OD260/OD280
>1.8     


2. バイサルファイト処理
パイロシークエンス法によりDNA配列のメチル化状態を解析するためには、まずDNAをsodium bisulfite で処理します。これにより非メチル化シトシン残基はウラシルに変換され、メチル化シトシンはそのままです。 この結果、判別可能な2つの異なる配列が得られます。

バイサルファイト変換とPCR 後の配列 

DNA 変換前の配列 バイサルファイト変換後 PCR増幅後
非メチル化DNA  A-C-G-T-C-G-T-C-A A-U-G-T-U-G-T-U-A A-T-G-T-T-G-T-T-A
メチル化DNA  A-C-G-T-C-G-T-C-A  A-C-G-T-C-G-T-U-A   A-C-G-T-C-G-T-T-A

3. プライマー設計、PCRコンディションセットアップ
ターゲット遺伝子の解析領域を検索して、PCRプライマーを設計します
※お客様より解析領域をご指定頂いた場合、指定領域に対してPCRプライマーを設計致します
PCRプライマーを合成して、PCRコンディションのセットアップを行います


4. PCR
バイサルファイト処理後、ターゲット領域をPCR増幅します
アガロースゲル電気泳動にてシングルバンドを確認後、PCR産物の精製を行います


5. TAクローニング
精製したDNAをpCR2.1ベクターTOPO TA cloning kitに混合してインキュベーションします
ライゲーションDNAはヒートショック法によりTOP10 competent cellsに形質転換されLB/amplicillindディッシュで 16時間42°Cでインキュベーションします



6. コロニーピッキング & シングルセル培養
バクテリアコロニー確認後、20個のコロニーをランダムに選択してLB/amplicillin培養液に入れインキュベーター (42℃)でOD600 > 0.5まで培養します

7. プラスミド抽出・精製
バクテリアからプラスミドを抽出
プラスミドに組み込まれたバイサルファイト後のDNA断片をEcoRI 制限酵素で処理後、アガロースゲルでバンドを確認



8. シーケンス
最少 15のプラスミドをシーケンスします


9. 解析

解析は10プラスミド/サンプルのシーケンス結果を報告致します